1980. aastate lõpus, nagu arenenud, on laserkonfokaalsel mikroskoopial aga suur viga: konfokaalne ava mitte ainult ei blokeeri fookuspunktist väljaspool genereeritud fluorestsentsi, vaid blokeerib ka fookuspunkti tekitatud fluorestsentsi, mis on hajutatud bioloogiliste kudede poolt. mille tulemusena väheneb fluorestsentsi kogumise efektiivsus ja pildistamise sügavus ei tohi olla suurem kui 100 mikromeetrit. Seetõttu tekkis 1990. aastatel kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopia, mis ühendas laserkonfokaalse mikroskoopia ja kahe fotoni ergastustehnoloogia. Kahe footoni neeldumisprotsessi ergastuslainepikkus on üldiselt seatud bio-optilise akna vahemikku 680-1080 nm, mis väldib ultraviolettvalguse kahjustamist rakkudele või elusorganismidele ja tungib sügavamale.
Praegu on kõige laialdasemalt kasutatav kahefotoni fluorestsentsmikroskoop femtosekundiline titaanist vääriskivilaser, mis on mahukas ja kallis, mis piirab kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopia kasutamist erinevates valdkondades, nagu bioteadused, keemia ja meditsiin. Nii et mõnes valdkonnas, nagu meditsiinidiagnostika, on inimesed proovinud standardse valgusallikana kasutada kompaktseid ja taskukohaseid sub-nanosekundilisi tahkislasereid.
Kahefootonilise ergastuse põhiprintsiip seisneb selles, et kui fluorestseeruvat molekuli ergastatakse suure footonitiheduse korral, neelab see samaaegselt kaks pikalainepikkust footonit ja kiirgab seejärel pärast ergastushüppeid ja lõõgastusprotsesse spontaanselt fluorestseeruvad footonid tagasi põhiolekusse. Võrreldes tavalise ühefotoni ergastusfluorestsentsmikroskoopiaga on kahe fotoni ergastusfluorestsentsmikroskoopia optilise signaali genereerimine mittelineaarne, kusjuures ergastusvalgus on pikema lainepikkusega, suurema tippvõimsusega valgusallikas ja emiteeritud fluorestseeruvatel footonitel on lainepikkus. veidi pikem kui pool ergastuse lainepikkusest.
Kahefotoni fluorestsentsmikroskoopia kasutab peaaegu infrapuna laservalgusallikat ja selle mittelineaarne olemus ei nõua konfokaalset ava. Seetõttu on kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopiaga võrreldes konfokaalse mikroskoopiaga järgmised eelised:
- Suur pildisügavus ja väike optiline kahjustus;
- Konfokaalset ava pole vaja ja fluorestsentsi kogumise efektiivsus on oluliselt paranenud;
- Suurem ruumiline eraldusvõime ja kontrastsus;
- Väike ergastusvahemik, väike fototoksilisus ja pleegitamine;
- Emissiooni ja ergastuse lainepikkused on üksteisest kaugel, vältides spektri kattumist;
